Totholz wird in der Ökologie und insbesondere im Biotop- und Artenschutz als Sammelbegriff für abgestorbene Bäume oder deren Teile verwendet. Grob unterteilt wird dabei zwischen stehendem Totholz, also noch nicht umgefallenen abgestorbenen Bäumen, und liegendem Totholz, das bereits auf dem Erdboden liegt.
Stehendes Totholz ist seltener und ökologisch wertvoller als Liegendes. Besonders selten sind alte dicke Bäume, an denen sich starkes Totholz entwickelt, so wie an dieser 200-jährigen Eiche in unserem Klimaeichen.de-Wald. Totholz wird durch eine Vielzahl von Organismen genutzt, die sich im Laufe der Evolution an diesen Lebensraum angepasst haben. Je nach Holzart und Zersetzungsgrad (Stand des Verfallsprozesses) sind etwa 600 Großpilzarten und rund 1.350 Käferarten an der vollständigen Remineralisierung eines Holzkörpers beteiligt. Zwischen Pilzen und Insekten bestehen unterschiedlichste Abhängigkeiten. Insekten übertragen Pilzsporen auf den Holzkörper, die Pilze können wiederum Nahrungsquelle und Teillebensraum für Insekten sein. Dies führt dazu, dass jeder Totholztyp mit seiner eigenen Flora und Fauna assoziiert ist. Es entstehen Lebensgemeinschaften in der Rinde, im Holz und in Baumhöhlen.
Viele Tiere und Pflanzen, die auf Totholz angewiesen sind, stehen auf der Roten Liste der vom Aussterben bedrohten Arten. Diese Arten sind in ihrer Lebensweise hochgradig auf bestimmte Zerfalls- und Zersetzungsphasen von Holz angewiesen. Pilze, Flechten, Moose, Farne und viele Insektenarten, wie etwa Ameisen und Schmetterlinge finden hier ihre Habitatnische. Der überwiegende Teil unserer 1.000 Wespen- und Bienenarten ist auf Alt- und Totholz angewiesen.
Die Bedeutung des Totholzes für den Artenschutz ist besonders gut bei den Käfern zu belegen. So leben rund 25 Prozent aller in Deutschland vorkommenden Käferarten am Holz verschiedener Zerfallsstadien. Die Gruppe der holzbewohnenden Käfer weist in Deutschland einen sehr hohen Anteil bedrohter Arten auf. Für eine Reihe von Käfern stellt Totholz auch ein Winterquartier dar, etwa für viele Marienkäfer.
Dickes Totholz bietet größeren Tieren die Möglichkeit, ihre Bauten und Nester anzulegen, und ist Lebensraum der Nahrung von Vögeln und anderen Wirbeltieren. Von den Insektenlarven im Holz ernähren sich die Spechte und andere heimische Vögel. Spechte zimmern ihre Bruthöhlen in lebende, aber auch abgestorbene Bäume oder Baumteile. Die so entstandenen Baumhöhlen werden, wenn die Spechte sie verlassen haben, von anderen Tieren als Nistplatz genutzt, so zum Beispiel vom Sperlingskauz und dem Waldkauz sowie von der Hohltaube oder Kleinsäugern wie Siebenschläfer und Eichhörnchen.
Auch Baummarder nutzen die Höhlen. Verlassene Spechthöhlen dienen außerdem einer Reihe von Fledermausarten als Sommer- und Winterquartier.